Spektrofotometri merupakan salah
satu metode dalam kimia analisis yang digunakan untuk menentukan komposisi
suatu sampel baik secara kuantitatif dan kualitatif yang didasarkan pada
interaksi antara materi dengan cahaya. Peralatan yang digunakan dalam spektrofotometri
disebut spektrofotometer. Cahaya yang dimaksud dapat berupa cahaya visibel, UV dan
inframerah, sedangkan materi dapat berupa atom dan molekul namun yang lebih
berperan adalah elektron valensi. Sinar atau cahaya yang berasal dari sumber
tertentu disebut juga sebagai radiasi elektromagnetik. Radiasi elektromagnetik
yang dijumpai dalam kehidupan sehari-hari adalah cahaya matahari.
Dalam interaksi materi dengan cahaya atau radiasi elektromagnetik, radiasi
elektromagnetik kemungkinanan dihamburkan, diabsorbsi atau dihamburkan sehingga
dikenal adanya spektroskopi hamburan, spektroskopi absorbsi ataupun
spektroskopi emisi.
Pengertian spektroskopi dan spektrofotometri pada dasarnya sama yaitu di
dasarkan pada interaksi antara materi dengan radiasi elektromagnetik. Namun
pengertian spektrofotometri lebih spesifik atau pengertiannya lebih sempit
karena ditunjukan pada interaksi antara materi dengan cahaya (baik yang dilihat
maupun tidak terlihat). Sedangkan pengertian spektroskopi lebih luas misalnya
cahaya maupun medan magnet termasuk gelombang elektromagnetik.
Radiasi elektromagnetik memiliki sifat ganda yang disebut sebagai sifat
dualistik cahaya yaitu:
1) Sebagai gelombang
2) Sebagai partikel-partikel energi yang disebut foton.
Karena sifat tersebut maka beberapa parameter perlu diketahui misalnya panjang
gelombang, frekuensi dan energi tiap foton. Panjang gelombang (l) didefinisikan
sebagai jarak antara dua puncak.
Hubungan dari ketiga parameter di atas dirumuskan oleh Planck yang dikenal
dengan persamaan Planck. Hubungan antara panjang gelombang
frekuensi dirumuskan sebagai
c = λ . v atau λ = c/v atau v = c/λ
|
Persamaan Planck: hubungan antara energi tiap
foton dengan frekuensi
E = h . v
E = h . c/ λ
|
dimana
E =
energi tiap foton
h = tetapan Planck (6,626 x 10-34 J.s),
v = frekuensi
sinar
c =
kecepatan cahaya (3 x 108 m.s-1).
Dari rumus di atas dapat
diketahui bahwa energi dan frekuensi suatu foton akan berbanding terbalik
dengan panjang gelombang tetapi energi yang dimiliki suatu foton akan
berbanding lurus dengan frekuensinya.
Misalnya: energi yang
dihasilkan cahaya UV lebih besar dari pada energi yang dihasilkan sinar tampak.
Hal ini disebabkan UV memiliki panjang gelombang (λ) yang lebih pendek (100–400
nm) dibanding panjang gelombang yang dimiliki sinar tampak (400–800 nm).
Interaksi antara materi dengan cahaya disini
adalah terjadi penyerapan cahaya, baik cahaya Uv, Vis maupun Ir oleh materi
sehingga spektrofotometri disebut juga sebagai spektroskopi absorbsi.
Dari 4 jenis spektrofotometri ini (UV, Vis, UV-Vis dan Ir) memiliki prinsip
kerja yang sama yaitu “adanya interaksi antara materi dengan cahaya yang
memiliki panjang gelombang tertentu”. Perbedaannya terletak pada panjang
gelombang yang digunakan.
sumber cahaya – monokromator – sel sampel – detektor –
read out (pembaca).
Fungsi masing-masing bagian:
1. Sumber sinar polikromatis berfungsi sebagai sumber sinar
polikromatis dengan berbagai macam rentang panjang gelombang. Untuk
sepktrofotometer
- UV menggunakan lampu deuterium atau disebut juga heavi hidrogen
- VIS menggunakan lampu tungsten yang sering disebut lampu wolfram
- UV-VIS menggunan photodiode yang telah dilengkapi monokromator.
- Infra merah, lampu pada panjang gelombang IR.
2. Monokromator berfungsi sebagai penyeleksi panjang
gelombang yaitu mengubah cahaya yang berasal dari sumber sinar polikromatis
menjadi cahaya monaokromatis. Jenis monokromator yang saat ini banyak digunakan
adalan gratting atau lensa prisma dan filter optik.
Jika digunakan grating maka cahaya akan dirubah menjadi
spektrum cahaya. Sedangkan filter optik berupa lensa berwarna sehingga cahaya
yang diteruskan sesuai dengan warnya lensa yang dikenai cahaya. Ada banyak
lensa warna dalam satu alat yang digunakan sesuai dengan jenis pemeriksaan.
Pada gambar di atas disebut sebagai pendispersi atau
penyebar cahaya. dengan adanya pendispersi hanya satu jenis cahaya atau cahaya
dengan panjang gelombang tunggal yang mengenai sel sampel. Pada gambar di atas
hanya cahaya hijau yang melewati pintu keluar. Proses dispersi atau penyebaran
cahaya seperti yang tertera pada gambar.
3. Sel sampel berfungsi sebagai tempat meletakan sampel
- UV, VIS dan UV-VIS menggunakan kuvet sebagai tempat
sampel. Kuvet biasanya terbuat dari kuarsa atau gelas, namun kuvet dari kuarsa
yang terbuat dari silika memiliki kualitas yang lebih baik. Hal ini disebabkan
yang terbuat dari kaca dan plastik dapat menyerap UV sehingga penggunaannya
hanya pada spektrofotometer sinar tampak (VIS). Cuvet biasanya berbentuk
persegi panjang dengan lebar 1 cm.
- IR, untuk sampel cair dan padat (dalam bentuk pasta)
biasanya dioleskan pada dua lempeng natrium klorida. Untuk sampel dalam bentuk
larutan dimasukan ke dalam sel natrium klorida. Sel ini akan dipecahkan untuk
mengambil kembali larutan yang dianalisis, jika sampel yang dimiliki sangat
sedikit dan harganya mahal.
4. Detektor berfungsi menangkap cahaya yang diteruskan dari
sampel dan mengubahnya menjadi arus listrik. Syarat-syarat sebuah detektor :
- Kepekaan yang tinggi
- Perbandingan isyarat atau signal dengan bising tinggi
- Respon konstan pada berbagai panjang gelombang.
- Waktu respon cepat dan signal minimum tanpa radiasi.
- Signal listrik yang dihasilkan harus sebanding dengan tenaga radiasi.
Macam-macam detektor :
- Detektor foto (Photo detector)
- Photocell, misalnya CdS.
- Phototube
- Hantaran foto
- Dioda foto
- Detektor panas
5. Read out merupakan suatu sistem baca yang menangkap
besarnya isyarat listrik yang berasal dari detektor.
Proses Absorbsi Cahaya pada Spektrofotometri
Ketika cahaya dengan panjang berbagai panjang gelombang (cahaya polikromatis)
mengenai suatu zat, maka cahaya dengan panjang gelombang tertentu saja yang
akan diserap. Di dalam suatu molekul yang memegang peranan penting adalah
elektron valensi dari setiap atom yang ada hingga terbentuk suatu materi. Elektron-elektron
yang dimiliki oleh suatu molekul dapat berpindah (eksitasi), berputar (rotasi)
dan bergetar (vibrasi) jika dikenai suatu energi.
Jika zat menyerap cahaya tampak dan UV maka akan terjadi perpindahan elektron
dari keadaan dasar menuju ke keadaan tereksitasi. Perpindahan elektron ini
disebut transisi elektronik. Apabila cahaya yang diserap adalah
cahaya inframerah maka elektron yang ada dalam atom atau elektron ikatan pada
suatu molekul dapat hanya akan bergetar (vibrasi). Sedangkan gerakan berputar
elektron terjadi pada energi yang lebih rendah lagi misalnya pada gelombang
radio.
Atas dasar inilah spektrofotometri dirancang untuk mengukur konsentrasi suatu
suatu yang ada dalam suatu sampel. Dimana zat yang ada dalam sel sampel
disinari dengan cahaya yang memiliki panjang gelombang tertentu. Ketika cahaya
mengenai sampel sebagian akan diserap, sebagian akan dihamburkan dan sebagian
lagi akan diteruskan.
Pada spektrofotometri, cahaya datang atau cahaya masuk atau cahaya yang
mengenai permukaan zat dan cahaya setelah melewati zat tidak dapat diukur, yang
dapat diukur adalah It/I0 atau I0/It (perbandingan
cahaya datang dengan cahaya setelah melewati materi (sampel)). Proses
penyerapan cahaya oleh suatu zat dapat digambarkan sebagai berikut:
Gambar Proses penyerapan cahaya oleh zat dalam sel sampel.
dari gambar terlihat bahwa zat sebelum melewati sel sampel lebih terang atau
lebih banyak di banding cahaya setelah melewati sel sampel
Cahaya yang diserap diukur sebagai absorbansi (A) sedangkan cahaya yang
hamburkan diukur sebagai transmitansi (T), dinyatakan dengan hukum lambert-beer
atau Hukum Beer, berbunyi:
“jumlah radiasi cahaya tampak (ultraviolet, inframerah
dan sebagainya) yang diserap atau ditransmisikan oleh suatu larutan merupakan
suatu fungsi eksponen dari konsentrasi zat dan tebal larutan”.
Berdasarkan hukum Lambert-Beer, rumus yang digunakan untuk menghitung banyaknya
cahaya yang hamburkan:
dan absorbansi dinyatakan dengan rumus:
dimana I0 merupakan intensitas cahaya datang dan
It atau I1 adalah intensitas cahaya setelah melewati
sampel.
Rumus yang diturunkan dari Hukum Beer dapat ditulis sebagai:
A= a . b . c atau A = ε . b . c
|
dimana:
A = absorbansi
b atau terkadang digunakan l = tebal larutan (tebal
kuvet diperhitungkan juga umumnya 1 cm)
c = konsentrasi larutan yang diukur
ε = tetapan absorptivitas molar (jika konsentrasi larutan
yang diukur dalam molar)
a = tetapan absorptivitas (jika konsentrasi larutan yang
diukur dalam ppm).
Secara eksperimen hukum Lambert-beer akan terpenuhi apabila peralatan yang
digunakan memenuhi kriteria-kriteria berikut:
- Sinar yang masuk atau sinar yang mengenai sel sampel berupa sinar dengan dengan panjang gelombang tunggal (monokromatis).
- Penyerapan sinar oleh suatu molekul yang ada di dalam larutan tidak dipengaruhi oleh molekul yang lain yang ada bersama dalam satu larutan.
- Penyerapan terjadi di dalam volume larutan yang luas penampang (tebal kuvet) yang sama.
- Penyerapan tidak menghasilkan pemancaran sinar pendafluor. Artinya larutan yang diukur harus benar-benar jernih agar tidak terjadi hamburan cahaya oleh partikel-partikel koloid atau suspensi yang ada di dalam larutan.
- Konsentrasi analit rendah. Karena apabila konsentrasi tinggi akan menggangu kelinearan grafik absorbansi versus konsntrasi.
Faktor-faktor yang sering menyebabkan kesalahan dalam menggunakan
spektrofotometer dalam mengukur konsentrasi suatu analit:
- Adanya serapan oleh pelarut. Hal ini dapat diatasi dengan penggunaan blangko, yaitu larutan yang berisi selain komponen yang akan dianalisis termasuk zat pembentuk warna.
- Serapan oleh kuvet. Kuvet yang ada biasanya dari bahan gelas atau kuarsa, namun kuvet dari kuarsa memiliki kualitas yang lebih baik.
- Kesalahan fotometrik normal pada pengukuran dengan absorbansi sangat rendah atau sangat tinggi, hal ini dapat diatur dengan pengaturan konsentrasi, sesuai dengan kisaran sensitivitas dari alat yang digunakan (melalui pengenceran atau pemekatan).
Spektrum UV, VIS, UV-VIS dan IR
Data-data yang dikeluarkan oleh UV atau VIS dapat berupa absorbansi atau transmitansi
yang langsung dibaca pada spektrofotometer. Namun untuk UV, VIS, UV-VIS dan IR
data yang dikeluarkan dapat berupa spektrum jika telah dihubungkan dengan
komputer.
Spektrum yang dikeluarkan oleh UV, VIS dan UV-VIS berupa pita yang lebar
sedangkan pada pita yang dikeluarkan oleh IR berupa garis atau puncak tajam.
Pita
melebar dari UV-VIS disebabkan karena energi yang dimiliki selain menyebabkan
transisi elektronik terjadi pula rotasi dan vibrasi elektron dalam molekul.
Sedangkan pada IR hanya terjadi vibrasi elektron maka spektrum yang dihasilkan
berupa garis atau puncak tajam. Selain pada IR, spektrum berupa garis dapat terjadi pula
pada spektroskopi NMR karena hanya terjadi rotasi elektron.
Spektrum yang dihasilkan dari setiap spektroskopi berbeda antara satu dengan
yang lainnya. Para kimiawan spektrum UV, VIS maupun IR dapat dibedakan
dengan mudah. Spektrum yang dihasilkan oleh UV, VIS dan UV-VIS tidak berbeda
jauh namun sangat sangat berbeda bila dibanding spektrum IR. Untuk
membedakannya dapat dilihat pada gambar:
Gambar spektrum UV. Namun spektrum dari spektrofotometer VIS
dan UV-VIS menyerupai spektrum UV
Gambar spektrum IR. Pita tertinggi mengarah ke bawah
sedangkan pada UV pita yang paling tinggi mengarah ke atas hal ini disebabkan
spektrofotometer IR ditulis dalam bentung bilangan gelombang